重磅！猴痘EUA template临床、分析方面的解读来啦！
美国当地时间9月7日（北京时间9月8日凌晨5点），美国卫生与公众服务部 (HHS) 部长正式宣布批准猴痘检测EUA，普瑞也是在第一时间监测到并为大家带来相关资讯！
普瑞的专家们也立马对EUA template的政策内容展开了解读。首先，先来说说一个最重要的事情：美国对于猴痘核酸试剂的取样方式是以皮损样本为主，那些计划做血清、血浆、口咽等取样方式的制造商们，要先好好考虑一下，是否要去挑战了。
关于比对试剂（comparator kit），FDA template原文写着：
关于化学裂解以及固相提取，在新冠EUA中也是这么要求，估计大家也很熟悉了。
而在当前，唯一获得FDA EUA授权的试剂就是QUEST猴痘检测试剂。该试剂一直是QUEST实验室的LDT试剂，目前已经获得EUA授权，可以作为其他同类型产品的比对试剂。这也给猴痘临床一直没有合适比对试剂的困境情况，提供了一个解决方案。但是，该试剂估计现在是处于有价无货的状态，不是有钱就能买到的，对此还有什么解决方案呢？
其实，除了EUA-authorized RT-PCR试剂外，还有一款美国疾控中心CDC研发、已被FDA获批（注意是cleared而非EUA-authorized）的非天花正痘病毒检测试剂盒，该款试剂盒可用于正痘病毒的检测，也可用于猴痘病毒的检测（配搭对应的引物探针组合）：
该款试剂盒是要在CDC授权的实验室中使用，而目前普瑞纯证已获得CDC猴痘检测引物探针试剂盒。
病毒材料应该以定量病毒添加到天然的阴性临床基质中来进行制备。
活病毒和灭活病毒是分析性能评估的首选材料，但也可以使用天然基因组DNA或合成的DNA，若选择后者，FDA建议对此先进行pre-EUA。
如果标本采集涉及拭子的使用，应该将病毒材料掺入拭子上，然后按照产品说明进行测试。
1. 检出限（LoD）
对于LoD的测定，首先应确定初始LoD，大概步骤为对病毒材料进行2-3倍系列稀释，每个浓度进行3个重复；然后再初始LoD的基础上进行20次重复，来确定最终的LoD结果。
若产品说明声称多种临床类型，那么，每个对应的临床阴性基质都需要进行评估LoD。
若产品是非天花的正痘检测试剂盒，那么，需要至少用两种非天花正痘病毒进行LoD的验证，或者可以使用合成DNA代替。
2. 包容性研究
主要完成生物信息学分析的包容性研究。
针对猴痘病毒的包容性分析主要包括：西非进化枝（clade II），刚果盆地进化枝（clade I），以及BEI提供的扎伊尔毒株。
而针对天非天花正痘病毒的包容性分析包括：猴痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、骆驼痘病毒、痘苗病毒等。
并针对公开数据库（如NCBI，GISAID等）适用的核酸序列进行包容性分析。
若配对比例低于100%，需要提供错配对性能影响的风险评估。
还需要持续监可能影响分子测试性能的新的病毒变体。
3. 交叉反应研究
需要对列举的33种病原体进行交叉反应测试。
对于没有进行测试的病原体需提供理由，并需要以生物信息学分析这些病原体与产品引物探针的配对比例，并标明二者同源性>80%的病原体。
4. 微生物干扰研究
从交叉反应研究中分析出与产品引物探针配对同源性>80%的病原体进行微生物干扰检测。
若不进行检测，需要说明为什么产品的测试性能不会受到临床上合并感染的病原体的影响。
或者解释计算机模拟结果与临床无关。
5. 内外源干扰物质研究
提供了20种内外源的干扰物质列表。
建议以2-3倍LoD对每种物质进行三次重复的检测。
6. 样本稳定性
对新鲜制备的3倍LoD的病毒材料进行室温2小时的样本稳定性评估。
若需要对冷冻的临床样品进行检测，则需要在等效性研究中评估新鲜和冷冻样品对性能评估的差异。
试剂稳定性，可仅提供方案。
由以上可以看出，与国内注册指导原则不同的是，美国EUA并未对precision作相关要求，并且在递交EUA的时候，关于stability上，只需要递交方案即可，测试数据可以在获得EUA授权后后补，这使得猴痘试剂EUA分析性能测试完成速度要比国内注册要快。
说回大家都最关注的临床试验本身。猴痘核酸试剂临床试验可以分成两个方案供制造商选择：
7. 前瞻、双盲、随机临床试验，这是最优选项
① 临床试验样本可以选择新鲜样本也可以选择冻存样本，如果是选择冻存临床样本，必须与新鲜临床样本做等效性测试，证明冻存临床样本不会对试验准确度有影响；
② 试验过程中需要使用盲法，则end user不应知道待测临床样本状态，以及end user不应知道待测样本的比对试剂测试结果（普瑞君在这里将end user理解为终端测试者，而非患者）；
③ 如果待注册试剂与比对试剂结果不一致，应该使用第二款EUA授权试剂进行重测；
④ 临床试验需要过伦理，并且要对受试者进行知情同意；
⑤ 临床样本中，要有20%的阳性临床样本为弱阳性临床样本，比对试剂的LOD值则为弱阳性临床样本的病毒浓度，这20%阳性临床样本的CT值偏差不得超过平均CT值的±3。
8. 人造样本，不是最优选项，但是是当前最快登陆EUA的选项
① 当前瞻或回溯临床样本都没办法获得时，FDA也允许使用人造样本进行临床试验。
② 人造阳性样本的浓度，一半是LOD值，另一半是不高于5倍LOD值；
③ 临床阴性基质不能使用样本池的方式，必须是每个阳性样本对应唯一临床阴性基质；
④ 当使用人造样本临床试验获得EUA初始授权后，还需要递交针对阳性临床样本测试作为额外补充。
以上不管选择哪项，都是需要30例阳性、30例阴性，不管是阳性、阴性一致率，都需要大于或等于95%。
通常核酸试剂都会有匹配的PCR设备和提取试剂盒、提取设备，临床和分析对于这些说明书上宣称的匹配测试体系产品，要求如下：
每个PCR仪器都需要进行LoD的测试：
○ 首先产品应在一台PCR仪器中确定不同提取方法的初始LoD和最终的LoD。
干扰物质应该使用最低分析灵敏度的提取方法和PCR仪器组合来进行评估。
包容性研究也应该使用最低分析灵敏度的提取方法和PCR仪器组合来进行评估。
交叉反应应使用所有的提取方法和PCR仪器的组合来评估。
临床研究应使用最低分析灵敏度的提取方法进行评估。
总的来说，如果从最周全的角度来看，当然是进行前瞻、盲法、随机临床试验，是最完美的，但世间的事往往就是鱼和熊掌不可兼得，最优解往往就伴随着耗时较长、不确定性较多的风险（受试者招募、伦理等问题），而EUA本身就是一项临时政策，按照新冠的经验，越早递交审批，审批的力度就是越宽松，越往后，就越难。
故普瑞君的建议是，先进行人造样本临床试验，同步准备真实临床样本的临床试验，例如准备伦理、知情同意等，同时开展相关的分析性能检测要求。当前普瑞纯证是拥有真实猴痘病毒提取出来的全基因组DNA、NIST（National Institute of Standards and Technology）的样本以及真实猴痘临床样本，能协助国内制造商最快登陆EUA。
以上是普瑞君对于当前猴痘EUA template临床、分析方面的解读，目前普瑞纯证已经就猴痘核酸试剂，向FDA递交pre-EUA申请，最终临床方案、分析方案会以FDA pre-EUA反馈意见为准。
